白细胞介素1β对大鼠髓核间质干细胞生物学特性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.002

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (28): 4437-4443.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.002

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

白细胞介素1β对大鼠髓核间质干细胞生物学特性的影响

张宁¹，关晓明¹，马迅²，张丽²，张辉¹，宋亮¹

¹山西医科大学，山西省太原市 030001；²山西大医院骨科，山西省太原市 030032

出版日期:2014-07-02 发布日期:2014-07-02
通讯作者: 马迅，硕士，教授，山西大医院骨科，山西省太原市 030032
作者简介:张宁，男，1987年生，山西省长治市长子县人，汉族，2014年山西医科大学毕业，硕士，主要从事脊柱退行性疾病的研究。
基金资助:
山西省自然科学基金资助项目(2011011042-3)；太原市大学生创新创业专题(120164064)；山西省研究生优秀创新项目(20113069)

Interleukin-1 beta affects the biological properties of rat nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells

Zhang Ning¹, Guan Xiao-ming¹, Ma Xun², Zhang Lⁱ², Zhang Hui¹, Song Liang¹

¹ Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China;² Department of Orthopedics, Shanxi Dayi Hospital, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China

Online:2014-07-02 Published:2014-07-02
Contact: Ma Xun, Master, Professor, Department of Orthopedics, Shanxi Dayi Hospital, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China
About author:Zhang Ning, Master, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Shanxi Province, No. 2011011042-3; the Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Project of Taiyuan City, No. 120164064; the Excellent Innovation Project of Shanxi Province for Postgraduates, No. 20113069

摘要/Abstract

摘要：

背景：内源性干细胞并未在椎间盘退变的进程发挥修复作用，作者推测可能与相关致病因素的异常作用有关，导致对髓核间质干细胞功能产生一定的抑制效应。
目的：观察炎症因子白细胞介素1β对大鼠髓核间质干细胞生物学特性的影响。
方法：取3月龄雄性SD大鼠脊柱腰段椎间盘髓核组织，用胶原酶，胰酶序贯消化法分离并培养髓核间质干细胞。采用流式细胞术检测细胞免疫表型CD24，CD34，CD45，CD90，CD105表达；利用RT-PCR检测干细胞基因SOX2，Nanog的表达。观察髓核间质干细胞成脂、成骨、成软骨分化能力。利用流式细胞术检测白细胞介素1β作用于髓核间质干细胞后的凋亡率，荧光定量PCR检测白细胞介素1β作用于髓核间质干细胞后SOX9，蛋白多糖，Ⅱ型胶原酶，caspase-3基因的表达变化。
结果与结论：体外分离培养出的细胞表现为纺锤样长梭形；CD90、CD105表达阳性，CD45、CD34、CD24表达阴性，表达干细胞基因SOX2，Nanog，具有成骨和成软骨分化能力，无成脂分化能力。CCK-8检测白细胞介素1β可以抑制髓核间质干细胞的增殖活性，与作用时间、作用浓度存在一定的依赖关系，最佳作用时间为48 h，最佳作用浓度为50 μg/L。流式细胞仪检测白细胞介素1β可以使髓核间质干细胞轻度凋亡；荧光定量PCR结果显示：SOX9，蛋白多糖，Ⅱ型胶原的mRNA表达下调，caspase-3表达上调。结果可见白细胞介素1β具有抑制髓核间质干细胞增殖活性并诱导其凋亡的作用，是导致椎间盘自身干细胞无法发挥修复作用的原因之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 髓核间质干细胞, 白细胞介素1β, 增殖活性, 凋亡, 大鼠, 山西省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Endogenous stem cells have no repair effects on the process of disc degeneration. Authors assumed that this maybe associate with abnormal effects of related etiological factor, resulting in an inhibitory effect on the function of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the effects of inflammatory cytokine interleukin-1β on biological characteristics of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells of rats.
METHODS: Lumbar spinal nucleus pulposus was obtained from 3-month-old male Sprague-Dawley rats. Nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells were isolated and cultured with collagenase and sequential trypsin digestion. The expression of CD24, CD34, CD45, CD90 and CD105 was detected using flow cytometry. Stem cell gene SOX2 and Nanog expression was measured using RT-PCR. Adipogenic, osteogenic and chondrogenic abilities of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells were observed. The apoptotic rate of interleukin-1β-treated nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells was detected using flow cytometry. Fluorescent quantitative PCR was used to measure the expression of SOX9, proteoglycan, type II collagenase
and caspase-3 gene after nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells were treated with interleukin-1β.
RESULTS AND CONCLUSION: Cells isolated and cultured in vitro showed spindle-like fusiform. Nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells were positive for CD90 and CD105, negative for CD45, CD34 and CD24. Nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells expressed SOX2 and Nanog, and were able to differentiate into osteocytes and chondrocytes, but not adipocytes. By the cell counting kit-8, interleukin-1β inhibited the proliferation capacity of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells, showing a dependent relationship with action time and action concentration. The optimum reaction time was 48 hours, and the optimal concentration was 50 μg/L. Flow cytometry detected that interleukin-1β induced a slight apoptosis of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells. Fluorescent quantitative PCR results revealed that mRNA expression of SOX9, proteoglycan, and type II collagenase was decreased, but caspase-3 was increased. Results indicated that interleukin-1β inhibited the proliferation of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells and induced the apoptosis of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells, and was a reason that intervertebral own stem cells could not exert repair effects.

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Key words: intervertebral disk, mesenchymal stem cells, interleukin-1 beta, cell proliferation, apoptosis

中图分类号:

R394.2

张宁，关晓明，马迅，张丽，张辉，宋亮. 白细胞介素1β对大鼠髓核间质干细胞生物学特性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(28): 4437-4443.

Zhang Ning, Guan Xiao-ming, Ma Xun, Zhang Li, Zhang Hui, Song Liang. Interleukin-1 beta affects the biological properties of rat nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(28): 4437-4443.

图/表（结果） 7

2.1 髓核间质干细胞的分离与培养原代细胞5-7 d贴壁，细胞形态以梭形较多，其中含有少量三角形及多边形，4周达到80%-90%融合，传代培养后细胞生长较原代培养明显加快，10-15 d后细胞即可融合，第3代细胞形态基本保持一致为纺锤样长梭形(图1)。

2.2 髓核间质干细胞鉴定来自大鼠的髓核间质干细胞CD90，CD105表达阳性，成熟髓核细胞标志CD24为阴性，造血干细胞标志CD45，CD34为阴性(图2)。髓核间质干细胞可表达“干细胞多能基因”SOX2，Nanog(图3)。髓核间质干细胞成骨诱导分化后用茜素红染色可见大量矿化钙结节呈红色；成软骨诱导培养后亚甲蓝染色成阳性，但是成脂肪诱导后用油红O染色示少量细胞内的脂滴被染色，可见其成脂肪能力较差(图4)。

2.3 白细胞介素1β对髓核间质干细胞增殖活性的影响髓核间质干细胞在白细胞介素1β的作用下，随着时间与浓度的增加，其增殖活性降低，差异有显著性意义。髓核间质干细胞的增殖活性与时间，剂量存在一定的依赖关系，最后筛选出白细胞介素1β最佳作用时间为48 h，最佳作用浓度为50 μg/L(表2)。

2.4 白细胞介素1β对髓核间质干细胞凋亡的影响通过CCK-8所筛选出的白细胞介素1β最佳作用时间48 h，最佳浓度50 μg/L作用于髓核间质干细胞(图5)，对照组的凋亡率为(2.13±0.12)%，实验组的凋亡率为(8.57±0.15)%，差异有显著性意义。

2.5 RT-PCR 检测髓核间质干细胞mRNA 表达变化荧光定量PCR分析实验组的Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 mRNA的表达量均低于对照组，其中蛋白多糖mRNA下调较低，说明白细胞介素1β可抑制髓核间质干细胞向软骨分化活动，同时发现caspase-3的表达上调(图6)。

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引言

腰背痛在大约80%人的一生中都会出现^[1]，不仅影响老年人，还有向25-60岁工作人群蔓延的趋势^[2-5]。腰背痛的发生多与椎间盘退变疾病的发生有关^[6-7]。椎间盘退变是一种细胞介导渐进性结构损害和椎间节段不稳的反应^[8]，这种椎间节段的不稳是神经受压的临床表现和背部疼痛的原因。长节段的椎间不稳最终能导致脊柱畸形和许多的临床疾病。预防和治疗椎间盘退变疾病有重大的意义^[9]。传统的治疗方法主要是将椎间盘切除、椎体融合术视为金标准，但是其治疗效果不理想^[10-11]，节段性改变终将会加速临近椎间盘退变^[12]。近年来应用组织工程方法治疗椎间盘退变已成为一个研究热点^[13]。干细胞是各个器官保持动态平衡和自我更新能力的关键，干细胞数量的减少和其功能的改变终将引起所构成器官的功能障碍^[13]。内源性干细胞的活化是保持椎间盘细胞动态平衡的一种途径。干细胞来源于身体不同的部位，包括骨髓组织、脂肪组织、滑膜组织等^[14-16]，关于干细胞的研究已拥有令人鼓舞的成果。一项最近的研究显示：移植自体骨髓间充质干细胞治疗疼痛与残疾方面有初步可喜的成果^[17]。但是始终存在一个问题：注入椎间盘内的间充质干细胞呈现出较低的生存率^[18-19]，由此推测是椎间盘的特殊环境发挥了十分重要的作用。近来多位学者研究发现椎间盘髓核中存在髓核间质干细胞^[20-24]，其对椎间盘微环境的适应性在组织工程研究中具有十分广阔的应用前景，然而内源性干细胞并未在椎间盘退变的进程中发挥修复作用，作者推测可能与相关致病因素的异常作用有关，导致对髓核间质干细胞功能产生一定的抑制效应。脊椎是身体的主干，椎间盘长度总和相当于脊柱三分之一，承担着必要的压力承载功能，并实现了脊柱的弯曲、屈曲、扭转，其是由3部分组成：位于中心的髓核、周围的纤维环以及椎间的终板组成^[25]。需要特别关注的是：椎间盘细胞的微环境十分特别-低氧、高酸、高度静水压、免疫豁免^[26-27]。椎间盘退变的主要表现为椎间盘细胞数量与细胞基质合成的减少^[28-29]，椎间盘细胞(尤其是髓核细胞)数量减少，活力降低，最终引起椎间盘的生理及生物力学特性发生改变。炎症因子所介导的炎症反应是导致椎间盘退变的重要因素之一^[30]。炎症因子包括白细胞介素1、肿瘤坏死因子、白细胞介素6、蛋白酶类(如基质金属蛋白酶)、一氧化氮等^[31-34]，可抑制椎间盘中细胞基质的合成代谢并加速分解，造成细胞新陈代谢失衡，同时伴随有细胞因子间相互促进效应及加重神经系统症状，最终加速椎间盘退变及其症状发生^[35]。内源性干细胞并未在椎间盘退变的进程中发挥修复作用，作者推测相关致病因素对髓核间质干细胞功能产生了一定的抑制作用，故本研究通过观察白细胞介素1β作用于大鼠髓核间质干细胞后的生物学特性变化，为进一步明确髓核间质干细胞在椎间盘退变过程的作用提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外实验观察。

时间及地点：实验于2013年1至7月在山西医科大学第二医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康雄性SD大鼠3只，清洁级，3月龄，体质量(320±17) g，由山西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(晋)2009-0001，屏障环境饲养。

实验方法：

大鼠髓核间质干细胞的分离与培养：采用文献[1-4]中的方法，在无菌条件下取出SD大鼠的髓核组织，立即浸于生理盐水中，洗净后，在超净工作台下，使用眼科剪分离出髓核组织，并将凝胶状髓核组织剪碎至组织块小于1 mm×1 mm×1 mm，加入0.2%Ⅱ型胶原酶37 ℃水浴箱中消化8-12 h，PBS洗涤2次，0.25%的胰蛋白酶溶液37 ℃水浴箱中消化约10 min，PBS洗涤2次，根据参考文献[20-21]使用添加体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养完全培养液终止消化，PBS洗涤2次，加入培养液并吹打均匀，将细胞分别接种于底面积为 25 cm²的培养瓶中，1周换液2次。细胞呈贴壁生长持续大约4周后，细胞达到90%融合可对细胞进行传代，以后每3 d传代1次。

大鼠髓核间质干细胞的鉴定：流式细胞术鉴定大鼠髓核间质干细胞的细胞表面标记。第3代细胞用0.25%胰酶(不含EDTA)消化脱壁，使用PBS清洗2次，细胞计数，分装入流式上机管，1×10⁵/管，重悬于20 μL PBS。分别加入FITC或PE标记抗大鼠抗体 CD24-PE，CD34-FITC，CD45-FITC，CD90-PE，CD105-PE，同时设定同型对照组，4 ℃孵育30 min，用2 mL PBS清洗后，再流式细胞仪上机检测，根据同型对照的荧光强度设定阴性细胞群，观察髓核间质干细胞表型的阳性细胞表达率。

大鼠髓核间质干细胞的干细胞基因表达：收集第3代髓核间质干细胞，应用RNeasy Mini Kit提取总RNA。根据GenBank登陆的大鼠Sox2、Nanog的基因序列，prime5.0引物设计见表1，Sox2的扩增产物长度为194 bp，Nanog的扩增产物长度为205 bp，PCR结束后，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，以鉴定髓核间质干细胞。

髓核间质干细胞的诱导分化培养：

成骨分化：取生长状态良好的第3代髓核间质干细胞，以1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于6孔板中2 mL，待细胞达到70%-80%融合后，加入成骨细胞诱导液，每3 d换液1次。诱导21 d后使用茜素红行钙化结节染色，镜下观察。

成脂分化：取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于6孔板中2 mL，待细胞达到70%-80%融合后，加入脂向分化诱导液，诱导3 d后换液，加入脂向分化维持液培养1 d，如此循环。诱导至14 d行油红O染色，观察脂滴形成情况。

成软骨分化：取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于6孔板中3 mL，待细胞达到70%-80%融合后，收集细胞，以不完全软骨诱导液(未加转化生长因子β3)洗涤1次，后再加入完全软骨分化诱导液(添加转化生长因子β3)，在离心管中培养，每3 d换液1次。诱导14 d后行甲苯胺蓝染色。

白细胞介素1β作用于髓核间质干细胞，观测其细胞生物学特性的变化：

CCK-8检测最佳作用时间与作用浓度：将对数生长期的大鼠髓核间质干细胞以1×10⁷ L^-¹接种于96孔细胞培养板中，每孔10³个细胞，检测白细胞介素1β作用于髓核间质干细胞的最佳浓度与最佳时间。分4组：对照组， 10 μg/L白细胞介素1β组，20 μg/L白细胞介素1β组， 50 μg/L白细胞介素1β组。每组设5个复孔，每孔100 μL生长液培养，37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱分别孵育24，48 h，加入CCK-8检测试剂10 μL/孔，在37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱孵育4 h，终止反应，酶标仪检测吸光值，检测波长450 nm。

细胞凋亡率检测：实验组(利用CCK-8筛选出的最佳作用时间与作用浓度)和对照组髓核间质干细胞加入6孔板，每组3孔，培养相同时间后，达到80%-90%的融合状态。用不含EDTA的胰酶消化后离心(1 000 r/min，5 min)，弃去上清，PBS重悬并调整细胞数大约5×10⁵个/管，每个处理组和对照组均制作3管细胞标本，每管细胞用PBS清洗1遍后，加500 μL buffer重悬细胞，再加5 μL的Annexin V-FITC和5 μL PI后室温避光孵育10 min后，用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，发射波长为530 nm，分别用不同的通道接收，用特定的软件分析，可获得任意一组的细胞凋亡率。

实时荧光定量PCR检测髓核间质干细胞的Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9、Caspase-3的mRNA表达变化：取第3代细胞，以1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种至6孔培养板中，分2组：实验组(由CCK-8筛选出的白细胞介素1β最佳作用时间与作用浓度)及对照组，培养相同时间(最佳时间)后，RT-PCR检测各组mRNA的表达，并同时扩增β-actin用来作为内参对照，β-actin的扩增产物长度为229 bp，Ⅱ型胶原的扩增产物长度为173 bp，蛋白多糖的扩增产物长度为94 bp，SOX9的扩增产物长度为110 bp，Caspase-3的扩增产物长度为255 bp(表1)。采用Trizol试剂盒提取各组髓核细胞mRNA；取5 μL RNA反转录，得到cDNA产物用于扩增目的基因；PCR扩增条件：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s，60 ℃34 s，40个循环。重复3组。所得各组Ct值以2^-^△△^Ct法表示，计算实验组与对照组的相对表达值。

主要观察指标：白细胞介素1β干预后髓核间质干细胞的增殖活性和凋亡情况；髓核间质干细胞的Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9、Caspase-3 mRNA表达变化。

统计学分析：使用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，组间资料比较主要使用单因素方差分析，多个样本均数两两之间的比较采用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

从SD大鼠髓核组织中分离培养的髓核间质干细胞传至第3代主要以梭形为主，有贴壁生长的特性，在传代培养后细胞形态无明显差别，拥有间质干细胞形态及生长特性。干细胞表面标志CD105、CD29 表达呈阳性，而不表达造血干细胞表面标志物 CD45、CD34与成熟髓核细胞标志物CD24；通过RT-PCR发现细胞可表达多能干细胞基因SOX-2、Nanog，而且该细胞拥有成骨与成软骨能力，但成脂能力相对较差，与文献[20-22]中结果相似，有学者推测与椎间盘微环境有关^[36]。综上结果表明实验所分离培养的细胞为髓核间质干细胞。炎症因子在椎间盘退变中发挥了不可或缺的作用^{[5, 37-40]}。炎症因子可以通过促进基质金属蛋白酶的提高，抑制椎间盘基质蛋白的合成^[41-45]，可促进椎间盘细胞的凋亡^[46]。Le Maitre等^[46]发现在退变的椎间盘中，白细胞介素1表达升高，并且导致了椎间盘基质合成与分解代谢失衡。Solovieva等^[47]通过研究发现：白细胞介素1β是椎间盘退变的始动因素。同时白细胞介素1β可以促进其他细胞因子发挥作用^[48-49]。也有证据证明白细胞介素1比肿瘤坏死因子α发挥了更重要的作用^[50]，均提示白细胞介素1β在椎间盘退变中发挥了重要作用，故选择了白细胞介素1β。

实验将白细胞介素1β作用于髓核间质干细胞，CCK-8试剂可用于简便而准确的进行细胞增殖和毒性分析。根据参考文献[46]选择了适当的时间组与浓度组。通过检测，发现白细胞介素1β对髓核细胞作用效果与剂量、作用时间有关，确定白细胞介素1β可抑制髓核间质干细胞的增殖活性，并筛选出其最佳作用浓度为50 μg/L，最佳作用时间为48 h。同时流式细胞术检测凋亡率发现，白细胞介素1β可以使髓核间质干细胞轻度凋亡，差异有显著性意义。

成熟髓核细胞与软骨细胞极为相似，髓核间质干细胞的成软骨分化能力在分子层面上的关键标志物为：SOX9，Ⅱ型胶原，蛋白多糖^[21]。在细胞凋亡的过程中Caspase家族起着关键的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在细胞间及细胞内凋亡信号传导的过程中发挥作用。在将白细胞介素1β作用于髓核间质干细胞后，通过荧光定量PCR观测其变化。结果证实，白细胞介素1β可抑制髓核间质干细胞的成软骨分化能力，并且使凋亡基因表达上调。实验发现：在椎间盘退变过程中，髓核间质干细胞的成软骨分化行为受到白细胞介素1β的抑制。

通过此次研究发现；白细胞介素1β确实抑制了髓核间质干细胞的细胞生物学特性，使得椎间盘细胞与基质代谢水平呈负平衡状态，对椎间盘的退变有一定作用。本文只是选择了一种有代表性的炎症因子作用于髓核间质干细胞，关于多种炎症因子对髓核间质干细胞的相互作用，还有待进一步研究。此次研究对了解椎间盘退变的病理生理过程有重要意义，同时对以后髓核间质干细胞的体内实验有一定的指导意义。

白细胞介素1β对大鼠髓核间质干细胞生物学特性的影响

Interleukin-1 beta affects the biological properties of rat nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells

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